Grundlagen der photometrischen Messung

Erfahren Sie hier, welche photometrischen Messverfahren es gibt. 

Einführung in die Photometrie

 

Photometrische Messverfahren haben eine lange Geschichte und werden seit über einem Jahrhundert eingesetzt. Ihre Wurzeln reichen bis ins 19. Jahrhundert zurück, als erste grundlegende Messmethoden entwickelt wurden. Heute ist die Photometrie ein integraler Bestandteil vieler wissenschaftlicher Disziplinen, einschließlich Biologie, Chemie, Ingenieurwissenschaften und Pharmazie. Sie wird in der Umweltanalytik, der medizinischen Diagnostik und der Qualitätskontrolle in der Industrie eingesetzt und gehört neben der pH-Messung zu den wichtigsten Messmethoden der Analytik.   

WTW ist seit über 30 Jahren im Bereich Photometrie tätig und hat über Jahrzehnte das komplexe Messverfahren der Photometrie vereinfacht, z.B. durch automatische Messeinstellungen und analytische Qualitätskontrollen (AQS). Für den Anwender bedeutet dies komfortables und schnelles messen. 

Neben der klassischen Laboranalytik gewinnt im Umweltmonitoring und der Trinkwasserüberwachung die mobile photometrische Messung immer mehr an Bedeutung.

Von Licht und Farben

Von Phos (griech.) für Licht und metrein (griech.) für messen

 

Abbildung 1: Das Spektrum lasst sich grob in drei Bereiche einteilen: Ultraviolettes Licht (UV) <380nm, sichtbares Licht ca. 380 – 780nm und infrarotes Licht (IR) >780nm.

Photometrie ist ein Verfahren, bei dem mit Hilfe einer Lichtquelle eine Lösung oder gelöste Probe analysiert wird. Durch eine Messung der Lichtabsorption der Probe, wird die Konzentration der enthaltenen Substanzen bestimmt. Dies ist möglich, weil Licht aus einem Spektrum von elektromagnetischen Wellen besteht, die von verschiedenen Stoffen unterschiedlich stark absorbiert werden.

Unterscheidung Photometrische und kolorimetrische Analyse

Die Kolorimetrie ist älter als die Photometrie und konzentriert sich speziell auf die Messung von Farben in Lösungen. Sie verwendet visuelle Farbvergleiche oder digitale Messungen, um die Konzentration gefärbter Substanzen zu bestimmen. Kolorimetrie arbeitet typischerweise nur im sichtbaren Spektrum.

Die Photometrie hingegen ist eine Methode zur Messung der Lichtintensität, die verwendet wird, um die Absorption oder Transmission von Licht durch eine Probe zu quantifizieren. Sie kann Wellenlängen im gesamten Spektrum, einschließlich UV- und Infrarotlicht, nutzen.

Messprinzipien

Was wird mit dem Photometer gemessen?

In der Photometrie werden drei grundlegende Messarten genutzt, die aufeinander aufbauen:

1. Transmission T (%): Wird direkt gemessen und ergibt sich aus dem Verhältnis von Lichtintensität nach (I) und vor (Io ) der Küvette. Die Transmission einer Probe verändert sich exponentiell mit Schichtdicke und Stoffkonzentration. Die Transmission wird auch zur Trübungsmessung bei 180° (Einheit FAU, z.B. in der Qualitätskontrolle) und für die Trübungskorrektur bei der Konzentrationsmessung eingesetzt.

   

Abbildung 2: Verhältnis von Lichtintensität nach (I) und vor (I_o ) der Küvette.

2. Extinktion E: Die Extinktion, auch als optische Dichte bezeichnet, ist ein Maß für die Abschwächung/“Auslöschung“ des Lichts durch die Probe. Berechnet wird sie aus dem Logarithmus der Transmission: E = - log₁₀ (T).  (Anmerkung: im Sprachgebrauch oft auch als Absorption bezeichnet) Die Extinktion in einer Probe verändert sich proportional zu Schichtdicke und Konzentration.

3. Konzentration: Hergeleitet über Extinktion oder Transmission. Quantitative Analyse einer Substanz (mg/l, ppm,…) bei definierter Wellenlänge auf Basis einer Kalibrierkurve.

Abbildung 3: Beziehung von Transmission/ Extinktion zur Konzentration.

Grundlagen der Konzentrationsbestimmung

Was sind die Voraussetzungen für eine Konzentrationsmessung

Abbildung 4: Definierte Reaktionszeit für die Farbentwicklung.

1.    Der Farbstoff liegt in gelöster Form vor.
2.    Die Färbung ist durch eine Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge λ nachweisbar.
3.    Die chemische Reaktion mit der Substanz führt zur Bildung oder Verminderung (z.B. CSB) des Farbstoffes 
4.    Die Farbreaktion hat eine fest definierte Reaktionszeit.
5.    Die Farbintensität korreliert mit der Konzentration.
6.    Die Reaktion muss selektiv für die gesuchte Substanz sein, es dürfen keine Kreuzreaktionen mit anderen Ionen auftreten.
7.    Die Färbung muss eine Zeitlang stabil sein, z.B. ein Zeitfenster von 10 Minuten nach Reaktionsende ohne Farbveränderung (siehe Analysenvorschriften).

Wie wird aus der Extinktion die Konzentration hergeleitet?

1. Durch ein photometrisches Spektrum werden der oder die spezifischen Absorptions-Peaks von Stoffen bestimmt. So kann die optimale Wellenlänge für Konzentrationsmessungen ermittelt werden.

2. Mehrer Lösungen mit einer bekannten Konzentration des untersuchten Stoffes werden bei  der festgelegten Wellenlänge gemessen. Die erhaltenen Extinktionswerte werden in Diagramm eingetragen. Daraus ergibt sich die Kalibrierkurve.

3. Anschließend kann die Stoffkonzentration einer unbekannten Lösung anhand des Extinktionswerts aus der Kalibrierkurve abgeleitet werden.

Worauf basiert die Konzentrationsmessung?

Das Lambert-Beer’sches Gesetz ist die Grundlage für die photometrische Konzentrationsbestimmung:

Die Abhängigkeit der Extinktion von der Konzentration des Analyten wurde von BEER (1825–1863) gefunden. Einige Zeit zuvor zeigten Untersuchungen von BOUGUER (1698–1758) und LAMBERT (1728–1777), dass die Extinktion von der Schichtdicke der Küvette abhängt. Die Kombination beider Gesetzmäßigkeiten führte zum Lambert-Beer‘schen Gesetz, das durch folgende Beziehung beschrieben werden kann:

E = ελ· c · d
ελ = molarer Extinktionskoeffizient l/(mol*cm) bei Wellenlänge λ
d = Schichtdicke der Küvette in cm
c = Analyt-Konzentration in mol/l

Photometer

Photometrie und Photometer haben sich in den letzten Jahrzehnten immer weiterentwickelt. Inzwischen werden große Teile der Messungen automatische durchgeführt. Küvettenschnelltests sowie vorprogrammierte Messmethoden und automatische Küvettenerkennung haben dem Prozess der photometrischen Analytik beschleunigt, die Genauigkeit erhöht und die Fehlerrate reduziert.

Lichtquellen und Optiken

Bestimmte Wellenlängen entstehen durch:

1.    Spezielle Lichtquellen für den UV- und VIS- Bereich:
•    LEDs: geringer Strombedarf, geringe Lichtintensität, wellenlängenspezifisch 
•    Wolfram-Halogen-Lampen: Weißlicht, für VIS-Bereich, häufig kombiniert mit 
•    Deuterium-Speziallampen: UV-Bereich, sehr teuer
•    Xenon-Blitzlampen: UV-VIS-Bereich, lange Lebensdauer 

2.    Unterschiedliche Optiken und Filteraufbauten:
•    Mono- oder Polychromatoren 
•    Filteroptiken
•    LED-Filter Kombination

 

Abbildung 5: Aufbau Mono- (A) und Polychromator(B).

Monochromatoren zählen zu den gebräuchlichsten optischen Elementen in Photometern. Sie dazu dient, eine bestimmte Wellenlänge aus einem einfallenden, breitbandigen Lichtstrahl zu isolieren. Die Funktionsweise basiert auf mehreren Schritten:

Abbildung 6: Monochromator der photoLab® 7000 Serie mit Referenzstrahl für höhere Genauigkeit.

1. Eingangsspalt: Das Licht tritt durch einen Eingangsspalt ein, wo es zunächst gebündelt wird, um parallele Lichtstrahlen zu erzeugen.
2. Dispergierendes Element: Das parallele Licht wird dann auf ein dispergierendes (lichtstreuendes) Element, wie ein Prisma oder ein optisches Gitter, geleitet. Diese Elemente brechen das Licht in seine verschiedenen Wellenlängen auf.
3. Austrittsspalt: Nach der Dispersion wird das Licht durch einen Austrittsspalt geleitet, der nur die gewünschte Wellenlänge durchlässt. Durch die Anpassung des Winkels des dispergierenden Elements kann der Benutzer die spezifische Wellenlänge auswählen, die für die Messung benötigt wird.
   
   Zu den Photometern

Abbildung 7: Abbildung 4: LED + optischer Filter, z.B. pHotoFlex® Serie.

LED-Filterphotometer sind ebenfalls weitverbreitet, sie sind jedoch in ihrem Aufbau deutlich einfacher und in ihren Einsatzmöglichkeiten eingeschränkt, da nur eine begrenzte Anzahl an Wellenlängen zu Verfügung stehen. Eine LED (Licht-emittierende Diode) erzeugt Licht in einer spezifischen Wellenlänge, die für die zu messende Substanz optimal ist. Zusätzlich wird ein optischer Filter wird verwendet, um das Licht auf die gewünschte Wellenlänge zu beschränken. Das gefilterte Licht wird durch die Probe geleitet. Ein Photodetektor misst die Intensität des Lichts, das die Probe passiert hat.

Methoden und Messungen

Wie bestimmt ein Photometer automatisch die Stoffkonzentration?

Damit ein Photometer automatisch einen Konzentrationswert ausgeben kann, benötigt das System zusätzlich zur Kalibrierkurve noch ein paar weiter Daten. Gespeicherte Daten für eine einfach und genaue photometrische Messung setzen sich zusammen aus:

1. Optimale Wellenlänge für die Messung
2. Reagenzienblindwert E₀ = Färbung des Reagenz
3. Steigungsfaktor
4. Zitierform und Einheit (z.B. NO₃-N mg/l)
5. Umrechnungsfaktoren für Wechsel von Zitierform und Einheit (z.B. NO₃; mmol/l)

Der Probenblindwert (z.B. gefärbte Proben) ist nicht enthalten! und muss bei deutlicher Probenfärbung manuell gemessen werden.

Durch die Färbung der Reagenzien (Reagenzienblindwert) und die Probenfärbung (Probenblindwert) verschiebt sich der Nullpunkt der Kalibrierkurve entlang der Extinktionsachse.

 

Abbildung 8: Kalibrierkurve für automatische Konzentrationsbestimmung.

Fragen und Antworten

Testsatzauswahl

Mit welchem Testsatz bekommt man möglichst genaue Messwerte?

Der tatsächliche Messbereich der Tests ist abhängig von den Geräten, die Reaktion hat Nachweisgrenzen. Messbereich-Werte in der Photometrie liegen bei Extinktionswerten zwischen -2 E (±0,5) und + 2 E (±0,5).

Am unteren Messbereich-Ende wirken sich Nachweisgrenze und Toleranz am stärksten aus: Verfahrenskenndaten wie Vertrauensbereich und die Genauigkeit sind häufig mit dem unterem Messbereichsende identisch. Kratzer, Pipettenfehler und andere Handhabungsfehler reduzieren die Genauigkeit der Messergebnisse zusätzlich und führen zu einer höheren Ungenauigkeit!

 

Abbildung 9: Vertrauensbereich und Genauigkeit bei einem Ammoniumküvettentest.

Die größtmögliche Genauigkeit erhält man bei Messungen in der Messbereichsmitte!

• Die Testsätze sollten somit entsprechend den zu erwartenden Werten ausgewählt werden.
• Für Erstbestimmungen eignen sich Test mit möglichst großem Messbereich.

Nullwerte und Gerätedrift

Warum und wann muss eine Nullmessung durchgeführt werden?

Die Messeigenschaften von Photometern können sich mit der Zeit oder durch externe Einflüsse (z.B. Temperatur, Luftfeuchte) verändern. Diese Veränderung wird als Drift bezeichnet. Durch die Nullung (siehe Handbuch) kann die Drift kompensiert werden.

LED Geräte, z.B. pHotoFlex® Serie

Tragbare Geräte verlangen häufig eine Nullung auf Grund von Transport und wechselnden Umgebungsbedingungen.

Spektralphotometer, z.B. photoLab® 7000 Serie

Werden meist unter konstanten Laborbedingungen eingesetzt. Geräte mit Referenzstrahl sind zudem sehr stabil und zeigen wenig Drift. Daher ist eine Nullung seltener notwendig. Für komplexe Messungen, wie Spektren, ist eine Nullung/Basislinie meistens Standard.

Testanleitungen zeigen teilweise die Empfindlichkeit mit der Korrelation Extinktion (E) zu mg/l. Die Auswirkung einer Drift ist direkt ablesbar:

 

Beispiel Ammonium-Test: 10 mE Drift ohne Nullung bedeutet 0.04 mg/l – also 10% vermeidbaren Fehlbefund – am unteren Messbereich!

Hier den ganzen Artikel als PDF zum Download:

Spektralphotometer in der Routineanalytik

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