Photometrische Messverfahren gehören neben der pH-Messung zu den wichtigsten Messmethoden. Sie werden in der Forschung und Lehre zur Erkundung neuer Stoffe oder enzymatischer und biochemischer Vorgänge angewandt. Im Umweltbereich dienen sie dem Monitoring von Umwelteinflüssen. In der Qualitätskontrolle finden sie bei Lebensmitteln und Getränken Anwendung. Die Methodik reicht von der Absorptions-/ Transmissionsmessung sowie Konzentrationsbestimmung bis hin zum Scan und der Kinetikmessung. Seit Jahrzehnten vereinfachte WTW das komplexe Messverfahren der Photometrie. Für den Anwender bedeutet dies komfortables und schnelles messen durch automatische Messeinstellungen und analytischer Qualitätskontrolle (AQS). Mobil photometrisch messen gewinnt im Bereich Umweltmonitoring auch zunehmend an Bedeutung.
Phos (griech.) für Licht
Photometrie ist ein Messverfahren, bei dem mit Hilfe einer Lichtquelle (wässrige) Lösungen analysiert werden können.
Licht ist physikalisch ein Spektrum von elektromagnetischen Wellen, das man in unterschiedliche Bereiche einteilt: Das sichtbare Licht liegt bei ca. 380 – 780 nm.
Photometrische / kolorimetrische Analyse
Die Bestimmung einer Substanz über ihre spezifische Farbreaktion und Lichtabsorption in Abhängigkeit zur chemischen Eigenschaft bei einer bestimmten Wellenlänge.
Einführung – Lichtquellen und Optik
Bestimmte Wellenlängen entstehen durch:
Unterschiedliche Lichtquellen:
- LEDs = geringster Strombedarf, geringere Lichtintensität
- Wolfram-Halogen-Lampen (Weißlicht; für VIS-Bereich)
- Xenon-Blitzlampen (UV-VIS-Bereich; lange Lebensdauer)
- Deuterium-Speziallampen (UV-Bereich; sehr teuer)
Unterschiedliche Optiken:
- Monochromatoren
- Polychromatoren
- Filteroptiken
- LEDs
Optik: Filter- und LED-Photometer
Filter Photometer mit Referenzstrahl: photoLab® S6/S12
LED + optischer Filter : photoFlex® Series
Monochromator der photoLab® 7000 Series
Messmodi
Welche Messarten werden mit einem Photometer durchgeführt?
Drei Messarten für die photometrische Analyse und ihre Beziehung zueinander:
1. Transmission T(%): Verhältnis von Lichtintensität nach (I) und vor (Io ) der Küvette
2. Extinktion: E = - log10 (T) oder “Auslöschen“ des Lichts beim Küvettendurchgang (Anmerkung: im Sprachgebrauch oft auch als Absorption bezeichnet)
3. Konzentration: Quantitative Analyse einer Substanz (mg/l, ppm,…) bei definierter Wellenlänge auf Basis einer Kalibrierkurve
Transmissions-Messung
Transmission ist das Verhältnis des durchgelassenen Lichts I / einfallenden Lichts I0
Die Transmission wird auch zur Trübungsmessung bei 180° (Einheit FAU, z.B. in der Qualitätskontrolle) und für die Trübungskorrektur bei der Konzentrationsmessung eingesetzt.
Extinktionsmessung
Extinktion = „Auslöschung von Licht“:
Jeder Stoff hat ein spezifisches Spektrum mit einem oder mehreren Absorptions-Peaks:Durch ein photometrisches Spektrum bestimmt man Maximum oder Optimum = Wellenlänge für Konzentrationsmessung.
Darstellung der Konzentrationsmessung
Die Konzentrationsmessung bei einer spezifischen Wellenlänge, die über passende LEDs, optische Filter und Weißlicht oder einen Monochromator erzeugt wird.
Beziehung von T% - Extinktion - Konzentration
Transmissions-Messung:
Die Transmission einer Probe verändert sich exponentiell mit Schichtdicke und Konzentration
Extinktions-Messung:
Die Extinktion in einer Probe verändert sich proportional zu Schichtdicke und Konzentration
100 10 1 0,1 Transmission (T%) - Logarithmisch
0 1 2 3 Extinktion E= -log10 (T) - Linearer Zusammenhang
0 4 8 12 Konzentration (mg/l) - Linearer Zusammenhang
Beziehung von %T - Extinktion - Konzentration
Lambert-Beer’sches Gesetz:
Untersuchungen von BOUGUER (1698–1758) und LAMBERT (1728–1777) zeigten, dass die Extinktion von der Schichtdicke der Küvette abhängt. Die Abhängigkeit der Extinktion von der Konzentration des Analyten wurde von BEER (1825–1863) gefunden. Die Kombination beider Gesetzmäßigkeiten führte zum Lambert-Beer‘schen Gesetz, das durch folgende Beziehung beschrieben werden kann:
E = ελ· c · d
ελ = molarer Extinktionskoeffizient in l/mol·cm
d = Schichtdicke der Küvette in cm
c = Analyt-Konzentration in mol/l
Methoden und Funktionsweisen in Photometern
Das Verhältnis von Extinktion/Konzentration wird durch eine Kennlinie = Kalibrierkurve für jede Substanz (Parameter) ermittelt.
Dazu muss die chemische Reaktion bekannt sein:
Verdünnungsreihe mit definierten Konzentrationen, gemessen bei spezifischer und Küvettengröße
- Kennlinie der Kalibrierkurve
- Unbekannte Probenkonzentrationen können von der Kurve “gelesen” werden
Methoden, Software und Programme in Photometern enthalten alle erforderlichen Kalibrierdaten und können das Ergebnis automatisch berechnen, auch für unterschiedliche Küvettengrößen. Testsätze mit Barcode rufen zudem die Methode (= Programm) automatisch auf.
Methodendaten für jeden Parameter
Gespeicherte Daten für eine einfach und genaue photometrische Messung setzen sich zusammen aus:
1. Richtige Wellenlänge für die Messung
2. Reagenzienblindwert E0 = Färbung des Reagenz
3. Steigungsfaktor
4. Zitierform und Einheit (z.B. NO3-N mg/l)
Umrechnungsfaktoren für Wechsel von Zitierform und Einheit (z.B. NO3; mmol/l)
5. Der Probenblindwert (z.B. gefärbte Proben) ist nicht enthalten!
„EProbe“ addiert sich zu E0 : probenspezifisch; bei kleinen Probenvolumen im Ansatz jedoch meist vernachlässigbar
Voraussetzungen für die Konzentrationsmessung
1. Der Farbstoff liegt in gelöster Form vor
2. Die Lichtextinktion erzeugt eine Färbung (komplementär zu λ)
3. Die Farbintensität korreliert mit der Konzentration
4. Die chemische Reaktion mit dem Substanz für zur Bildung oder Verminderung (z.B. CSB 4-40 mg/l) der Färbung in einer definierten Reaktionszeit
5. Die Reaktion muss selektiv die gesuchte Substanz umsetzen, es dürfen keine Kreuzreaktionen mit anderen Ionen auftreten
6. Die Färbung muss eine Zeitlang zur Messung stabil sein => z.B. ein Zeitfenster von 10 Minuten nach Ausreagieren ohne Farbzersetzung (siehe Analysenvorschriften)
Geräteüberprüfung – AQS
Selbsttest und Aufwärmzeiten vor allem für Kinetik und Spektren
AutoCheck:
Geräteabgleich gegen Luft im Hintergrund bei photoLab®
Null / Basislinie:
Abgleich auf „E0“
Wichtig nach Transport und wechselnden Umgebungsbedingungen
(Temperatur!), da die Gerätenull um einige mE „driftet“
Die Folge ist: Die Messergebnisse sind weniger genau (häufig zu hoch!)
AQS-Prüfmittel:
1. Optische oder Flüssigfilter
2. Farblösungen, z.B. PhotoCheck®
3. Unverkratzte, saubere Küvetten
4. Kontrollstandards der Substanz
FAQ Testsätze – Kurzer Überblick
Messbereich (MB) von Tests:
Der Bereich ist abhänig von den Geräten, die Reaktion hat Nachweisgrenzen. Messbereich-Werte in der Photometrie liegen bei max. ± 2 - 2,5 E (je nach Test).
Am unteren Messbereich-Ende wirken sich Nachweisgrenze und Toleranz am stärksten aus: Verfahrenskenndaten wie Vetrauensbereich und die Genauigkeit fallen meist mit dem unteren Messbereichsende zusammen.
Beachte: Kratzer, Pipettenfehler und andere Fehler in der Handhabung der Messgeräte beeinflussen die Genauigkeit der Messergebnisse zusätzlich und führen zu einer höheren Ungenauigkeit!
Man sollte also immer in der Messbereichsmitte messen!
FAQ – Die Bedeutung der photometrischen Null
Die Nullung (siehe Handbuch)
LED Geräte, z.B. pHotoFlex® Serie
Tragbare Geräte verlangen häufig eine Null auf-grund von Transport mit wechselnden Bedingungen und Optik.
Filterphotometer, z.B. photoLab® S12
Unter Laborbedingungen und mit Referenzstrahl extrem stabil mit wenig Drift, Nullung seltener.
Spektralphotometer, z.B. photoLab® 7000 Serie
Nullung/Basislinie ist Standard für viele Aufgaben, im Konzentrationsmodus analog zu Filtergeräten.
Gerätedrift - Nullen
Testanleitungen zeigen teilweise die Empfindlichkeit mit der Korrelation Extinktion (E) zu mg/l. Die Auswirkung ist direkt ablesbar:
Für CSB-Test 14560, 4-40 mg/l CSB, bedeuten 10 mE 0,4 mg/l CSB. 10 mE Drift ohne Nullung bedeutet 0.4 mg/l – also 10% vermeidbaren Fehlbefund – am unteren Messbereich!
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Spektralphotometer in der Routineanalytik
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