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Photometrische Bestimmung von D-Glucose

Spezial/Multiwellenlängen-Methode mit
WTW photoLab® UV-VIS Spektralphotometern

Photometrische Bestimmung von D-Glucose:

Photometer WTW Spektralphotometer PhotoLab 6600 UV/VIS oder PhotoLab 7600 UV/VIS
Test Enzymatischer UV-Test D-Glucose (10 716 251 035) der Firma BOEHRINGER
MANNHEIM / R-BIOPHARM
Methode Spezial / Multi-Wellenlänge
Messung Probe und Leerwert bei 340 nm

Inhaltsverzeichnis:

Inhalt dieser Dokumentation

  • Teil 1: Allgemeine Beschreibung
  • Teil 2: Analysenvorschrift
  • Teil 3: Methodenparameter; Formeldesign
  • Teil 4: Programmierung der Methode

Teil 1: Allgemeine Beschreibung

Bei der enzymatischen Umsetzung von D-Glucose zu D-Gluconat-6-Phosphat wird eine äquivalente Menge des Oxidationsmittels Nicotionamid-Adenin-Dinucleotid / Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NAD+/NADP+) zu NADH/NADPH reduziert. NADH/NADPH besitzt bei 340 nm eine spezifische Absorption und kann photometrisch bestimmt werden.

Abbildung 1: Extinktionsspektrum NAD+/NADP+ und NADH/NADPH.

Teil 2: Analysenvorschrift

Durchführung der Bestimmung

Glucose aus Disacchariden wird nur nach vorherigem Aufschluss erfasst.

Probe    Photometer

In eine leere 10 mm Rechteckküvette
werden gegeben:

Auswahl Multi-Wellenlängen Methode:
Glc(f) 716 251, 10 mm

    

1,000 ml  - Reagenz 1, NADP und ATP
+ 0,100 ml  - Probe
+1,900 ml  - bidest. Wasser
mischen
3 min. - Reaktionszeit

Dilution
Verdünnungsfaktor einstellen. Der Verdünnungsfaktor multipliziert das Ergebnis mit dem hier eingestellten Zahlenwert.

 

1. Extinktionsmessung

Glc(f) + NADP/ATP

Messung der D-Glucose nach Zugabe von Reagenz 1, Probe und
bidestilliertem Wasser

Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.

 

Nach der Messung die Küvette mit der Analysenlösung zur
Weiterbearbeitung aus dem Küvettenschacht nehmen.

In dieselbe Küvette werden gegeben:

+ 0,020 ml Reagenz 2, G6P-DH und HK
mischen
10 - 15 min. Reaktionszeit


 

2. Extinktionsmessung

Glc(f) + HK/G6P-DH

Messung der D-Glucose nach Zugabe von Reagenz 2

Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.

 

Nach der Messung Küvette aus dem Küvettenschacht nehmen.


Weiter mit: „Leerwert - Bestimmung“

Leerwert Photometer

In eine leere 10 mm Rechteckküvette
werden gegeben:

1,000 ml Reagenz 1, NADP und ATP
+2,000 ml bidest. Wasser
mischen
3 min. Reaktionszeit

 

3. Extinktionsmessung

BV + NADP/ATP

Messung des Leerwertes nach Zugabe von Reagenz 1 und bidestilliertem Wasser

Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.

 

Nach der Messung die Küvette mit der Analysenlösung zur
Weiterbearbeitung aus dem Küvettenschacht nehmen.

In dieselbe Küvette werden gegeben:

+ 0,020 ml Reagenz 2, G6P-DH und HK
mischen
10 - 15 min. Reaktionszeit

 

4. Extinktionsmessung

BV + HK/G6P-DH

Messung des Leerwertes nach Zugabe von Reagenz 2

Küvette in den Küvettenschacht stellen; die Messung wird automatisch gestartet.

 

Das Ergebnis wird angezeigt

Teil 3: Methodenparameter und Formeldesign

Konzentrationsberechnung:

Hierbei gilt: 

c Ergebnis
V Testvolumen [ml] Analysenlösung 3,020 ml
MG Molgewicht Glucose 180,16 g/mol
ε Molarer Extinktionskoeffizient (NADPH) Bei 340 nm = 6,3 [L / mmol / cm]
d Schichtdicke 1,00 cm (10 mm)
v Probenvolumen [ml] 0,100 ml
1000 Divisor für die Ergebnisanzeige in g/L
ΔE Extinktionsdifferenzen von Probe und Leerwert ΔE = (E2-E1)Probe - (E2-E1)Leerwert
[g/L] Dimension des Ergebnisses


Potometrischer Faktor (F) und Messbereich:

Rechteckküvette 10 mm bei 340 nm
F = 0,864
Messbereich: 0,08 – 0,5 g/L Glucose


Formeldesign:

Die Reihenfolge der Extinktionsmessungen folgt dem Schema des Test-Herstellers.

Die Reihenfolge der Messungen der Formel-Variablen innerhalb der Photometer Programmierung folgt dem Index der Formel-Variablen in aufsteigender Richtung.

Für die Anordnung der Formel-Variablen im Ablauf Schema der praktischen Durchführung gibt es verschiedene Möglichkeiten. In dieser Dokumentation wird davon lediglich eine Variante berücksichtigt.

Glukose Berechnung
Extinktionsdifferenzen

ΔEGlc = (E2Glc – E1Glc) – (E2Leerwert – E1Leerwert)

Hierbei gilt:

Messung
ΔEGlc Differenz der Extinktionsmessungen
E1Glc 1. Absorptionsmessung der Probe
E2Glc 2. Absorptionsmessung der Probe
E1Leerwert 1. Absorptionsmessung des Leerwertes
E2Leerwert 2. Absorptionsmessung des Leerwertes

Für die Berechnung der Extinktionsdifferenzen und Berücksichtigung des photometrischen Faktors sowie einer möglichen Messbereichserweiterung durch Vorverdünnung kann die erweiterte Formel für die Programmierung des Photometers folgendermaßen aussehen:

R = 0,864 * ((A340nm_2 - A340nm) – (A340nm_4 + A340nm_3)) * K1

Hierbei gilt:

R Ergebnis in g/L
0,864 Photometrischer Faktor bei der Glucose Bestimmung in der 10 mm Rechteckküvette bei 340 nm.
A340nm 1. Formelvariable, Index = 1; entspricht: E1Glc
A340nm_2 2. Formelvariable; Index = 2; entspricht: E2Glc
A340nm_3 3. Formelvariable; Index = 3; entspricht: E1Leerwert
A340nm_4 4. Formelvariable; Index = 4; entspricht: E2Leerwert
K1 Verdünnungs- / Multiplikationsfaktor

Teil 4: Programmierung der Methode

Bei der manuellen Eingabe der Programmdaten für eine neue Methode zur Bestimmung von Glucose, folgende Werte einstellen:



Wert Eingabe ** Beschreibung
Nummer * Geräteabhängig Listennummerierung, beliebig wählbar in diesem Bereich, jede Zahl in diesem Bereich kann jedoch nur einmal vergeben werden.
Name * Glc(f) 716 251, 10mm Bezeichnung des Verfahrens für Listenauswahl; beliebig wählbar, Glc = Glucose; 716 251 Bestellnummer des Herstellers, 10mm = Programmierung für 10 mm Rechteckküvette, max. 20 Zeichen;
Version * 1 Angabe des Programmierers, max. 5 Zeichen
Zitierform * Glucose Bezeichnung des Ergebnisses, max. 15 Zeichen
Einheit * g/L Konzentrationsangabe des Ergebnisses in g/L, max. 10 Zeichen
Auflösung 0.01 2 Nachkommastellen für die Anzeige des Ergebnisses, Auswahl aus vorgegebener Liste
Küvette 10 mm Auswahl aus vorgegebener Liste
Messbereich Untergrenze * 0.08 g/L niedrigster sinnvoller Messwert
Messbereich Obergrenze * 0.50 g/L höchster sinnvoller Messwert




Wellenlänge 1 340 nm Alle Messungen erfolgen bei dieser Wellenlänge




Ablaufvariablen Beschriftung Beschreibung
K1 * Dilution

Messbereichserweiterung; der Multiplikations- / Verdünnungs-Faktor mit dem das Ergebnis multipliziert wird wenn eine Vorverdünnung der Probe vorgenommen wurde. Beschriftung: max 10 Zeichen.

Der Wert wird zur Laufzeit der Methode vom Anwender eingegeben.
(max. 10 Ablaufvariablen)




Berechnungsformel** Eingabe von Zahlen, Variablen und Operatoren über die Tastatursteuerung des Photometers oder über eine externe USB-Tastatur.
(mehr als 250 Zeichen möglich)
R = 0.864 * ((A340nm_2 - A340nm) - (A340nm_4 - A340nm_3)) * K1




Bedingung** Nach Boehringer Mannheim: Die gemessenen Extinktionsdifferenzen sollten zur Erzielung eines ausreichend präzisen Ergebnisses mindestens 0.100 Extinktionseinheiten betragen.
((A340nm_2 - A340nm) - (A340nm_4 - A340nm_3)) > 0.1
oder
R > 0.08




Bezeichnung Beschriftung Beschreibung (max. 20 Zeichen)
Messung 1 * Glc(f) + NADP/ATP 1. Absorptionsmessung, Probe nach Zugabe des NADP Reagenzes.
Messung 2 * Glc(f) + HK/G6P-DH 2. Absorptionsmessung, Probe nach Zugabe von Hexokinase.
Messung 3 * BV + NADP/ATP 3. Absorptionsmessung, Leerwert nach Zugabe des NADP Reagenzes.
Messung 4 * BV + HK/G6P-DH 4. Absorptionsmessung, Leerwert nach Zugabe von Hexokinase.

* Einstellungen und Beschriftungen sind frei wählbar; Anzahl der Zeichen ist begrenzt.
** Das Dezimaltrennzeichen bei der Zahleneingabe ist der Punkt ‚.‘

Hier den ganzen Artikel als PDF zum Download

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